ELISPOT（Enzyme-linked Immunospot Assay）全名为酶联免疫斑点检测，结合了细胞培养技术与酶联免疫吸附技术，能够检测到单个细胞分泌的细胞因子情况。简单来说，就是用包被好的抗体捕获培养中的细胞分泌的细胞因子，并以酶联斑点显色的方式将其呈现出来。ELISPOT 实验原理ELISPOT 实验使用 PVDF 膜为底的 96 孔板（cat：MSIPS4510，Millipore），包被上特异性的单克隆抗体（需要无毒，不含内毒素，亲和力高的抗体），以捕获细胞分泌的细胞因子。然后在培养板的孔内加入待检测的细胞和抗原刺激物进行培养。在刺激物的刺激下，T 细胞就会在对应的时间段分泌对应的细胞因子。此时细胞因子就被包被在膜上的抗体所捕获。洗去细胞后，被捕获的细胞因子可以与生物素标记的第二抗体结合，然后用酶标亲和素与生物素结合，进行化学酶联显色，就可以在膜的局部形成一个个圆形的斑点（当然，也可以使用荧光素标记的第二抗体，这样就省去了后续的化学显色方法，并且一次可以检测多种细胞因子），每一个斑点就对应了当初一个分泌细胞因子的细胞。统计膜上的斑点的数目，再除以当初加入孔内的细胞总数，就可以计算出阳性细胞的百分比。该技术有以下三大优点：一：灵敏度高。一百万个细胞中只要有一个细胞分泌细胞因子就可被检测出来，相对于传统的 ELISA 方法提升了 2～3 个数量级。二：单细胞水平，活细胞功能检测。ELISPOT 是用抗原直接刺激活细胞，检测的是活细胞的功能。三：操作简便经济，可进行高通量筛选。ELISPOT 没有复杂的细胞体外扩增过程，不使用同位素，按照标准化的实验操作，一个实验者可以同时处理数百个样品，效率远远高于其它检测方法。以上只是 ELISPOT 的原理，下面直接上干货：标准 protocol。综合了 nature protocol（Guidelines for the automated evaluation of Elispot assays），CTL，Mabtech 和其他若干 paper 的经验，写下了这篇标准 protocol，一步步走向成功。以检测 IFN-γ 为例，本人已经做了 20 多次，屡试不爽，先 show 几张图吧：ELISPOT 实验步骤准备实验，建立好 plate 布局，至少用 3 个复孔来测试每一个条件，用 4～6 个复孔来优化阴性对照。第 1 天A. 准备 ELISPOT plate（需要无菌条件）1. 使用无菌的 pH 7.4 的无钙镁离子的 1 × PBS（即 DPBS）（0.22 μm 滤器过滤）稀释包被抗体（cat：3420-2 H，Mabtech）（1-D1K：1 mg/ml）至 15 μg/ml（1.5 μg/100 μl）。2. 取出 Millipore 96-well PVDF ELISPOT plate（cat：MSIPS4510，Millipore），每孔加入 15 μl 35% 乙醇处理 2 min。3.  无菌水（0.22 μm 滤器过滤）清洗 plate 5 遍，每次每孔加入 200 μl。4.  最后一遍弃掉液体后，轻轻在无菌纸上扣干（注意：一定要轻，以防损伤 PVDF 膜）。5.  每孔加入 100 μl 步骤 1 稀释的 1-D1K 抗体溶液，4～8 ℃ 孵育过夜。第 2 天B. 在 plate 中培养细胞（需要无菌条件）6. 准备细胞。如果是液氮冻存的细胞，复苏后计数，然后在 37 ℃，5% CO2  条件下使得细胞恢复以达到一个较高的密度。注意：culture medium 中的 serum 要预测试其合适性，因为 serum 的选择极大影响背景反应水平和细胞的总体反应。7. 准备刺激物。ELISPOT 实验应该有的 control：Con1：只有细胞 cell alone for background reactivity。Con2：只有培养基 medium alone for false positive spots。Con3：细胞和丝裂原（如 PHA）cell plus motigen for overall assay functionality。Con4：细胞和对照多肽库 cell plus control peptide pool for internal sample control。Con5：外部趋势对照，1～2 个参照样品用以测试培养基，对照抗原和丝裂原 external trending control, typically consisting of 1–2 reference samples tested against medium alone, a control antigen (e.g., peptide pool against which those samples exhibit a detectable response) and mitogen。Positive control：CEF peptide pool 和 PHA 刺激。CEF peptide pool（cat：PM-CEF-E，JPT）：先用纯的 DMSO（40 μl）溶解，再用 1 × PBS 稀释到终浓度，DMSO 的终浓度必须小于 1%，以免细胞毒性。PHA：先加 1 ml 无菌的 DPBS 或者细胞培养基到 5 mg 的 PHA 凝集素中，轻轻混匀溶解，使用之前再用无菌的 buffer 稀释到所需的工作液浓度。注意不要过滤以免损失。CEF peptide pool 和 PHA 要稀释到 2 × 的终浓度。Negative control：培养基 +DMSO，DMSO 浓度和 CEF peptide pool 中终浓度一致。8. 去除 plate 中的抗体，无菌 PBS 清洗 plate 5 遍，每次每孔 200 μl。9. 最后一遍弃掉液体后，轻轻在无菌纸上扣干。10. 封闭 plate：每孔加入 200 μl 1% BSA（0.22 μm 滤器过滤），室温孵育至少 30 min。11. 去除封闭液，加入 50 μl CEF peptide pool，PHA，阴性对照和刺激物到合适的孔中。12. Gently 铺板细胞，每孔 50 μl culture medium，2～4 × 105 cell/ml（具体的细胞数目需要做梯度摸索），轻拍板的边缘使得细胞均匀铺开，然后放入培养箱，37 ℃，5% CO2  培养 16～20 h。注意 1：步骤 11 和 步骤 12 可以合为一步，即先把细胞和刺激物混匀后再加入对应的孔中。注意 2：培养期间不要移动 plate，并且采取措施防止蒸发，可以使用铝箔纸包裹 plate。第 3 天13. 去除 plate well 中的细胞，然后用 PBS+ 0.05% Tween-20 清洗 well 4～6 遍以完全去除细胞，每次 200 μl。注意：细胞去除不完全会破坏 spot 的形成。14. 用 0.5% BSA in 1 × PBS 或者 0.5% FCS（胎牛血清）in 1 × PBS 稀释生物素标记的检测抗体 7-B6-1-biotin 至 1 μg/ml，再用 0.22 μm 低蛋白结合的滤器过滤，然后每孔加入 100 μl，37 ℃ 孵育至少 2 h。15. 清洗 plate well，参考步骤 3（第 2 天）。16. 用 0.5% BSA in 1 × PBS 或者 0.5% FCS（胎牛血清）in 1 × PBS 稀释链霉亲和素 -HRP（streptavidin-HRP），每孔加入 100 μl，室温孵育至少 1 h。注意 1：根据显色底物来决定过氧化物酶结合物（peroxidase conjugate）的稀释度。 底物为 AEC，推荐 1:100 稀释度。底物为 TMB，推荐 1:500～1:1000 稀释度。注意 2：HRP 结合物（HRP-conjugates）不能在含有叠氮化钠的 buffer 中使用，因为叠氮化钠会抑制酶的活性。17. 使用 1 × PBS 清洗 plate well 4～6 遍，每次 200 μl。注意：不要使用带有 Tween-20 的 washing buffer，因为 Tween-20 会干扰 spot 的形成。18. 加入底物 TMB，每孔 100 μl，直至清晰的 spots 出现。注意：底物 AEC/TMB 稀释后要用 0.45 μm 滤膜过滤。19. 用去离子水来终止显色反应。20. 去除 plate underdrain 上所有多余的液体，用纸巾将孔的背部彻底擦干。注意：残留的底物会引起孔中的色斑。21. plate 在黑暗环境中过夜，彻底晾干。22. 使用 ELISPOT reader 观察计数。ELISPOT reader 使用方法读板1. 开机：先开 ELISPOT reader，再开电脑。2. 选择 CTL。3. 选择扫描软件，即 capture。4. 进入扫描向导模式，选择 plate 类型，MSIP45。5. 选择保存路径，可以修改。6. 点击 eject，弹出载物台，放好 plate。注意：板子的 A1 孔要和载物台的 A1 位置对准，然后在弹出的对话框中命名，点击 load。7. 点击 Preselect Wells，可以选择列-column，行-row，单孔-single。8. 修改曝光时间：退出向导，点击 preference，这里有仪器的全部设置。点击 image capture setting，在 exposure setting 里，勾选 modify exposure time，然后可以修改曝光时间。 9. 选择 auto center for each well，即相机镜头自动对准样品孔。10. 点击 start，开始读板。分析1. 点击分析软件。2. 进入选择界面。左边一栏：选择斑点类型，Normal：背景比较干净的；Normal diffuse：斑点弥散，有点背景的；中间一栏：counting module，一般选择智能计数—smart count；右边一栏：质控-quality control。3. 点击 Smart count。（1）选择板子—load plate（2）定义计数参数—define counting parameter测试斑点识别的精度，即双击需要识别的孔即可。斑点识别的是否精确，否的话需要调节参数，Diffuse processing，有 small，large 等可选；在出现白斑的情况下勾选 fill holes 选项；调大 spot separation 可以使连接的斑点分离；勾选 hair removal 可以去除头发丝状杂质；调小 count area 可以去掉已经选中的孔边缘深色非斑点部分；勾选 normalize counts 可以根据斑点的平均分布估算红圈外未选中区域的斑点个数，未勾选则完全删除红圈外的斑点个数，数字后会有一个 *，* 代表有估算的内容在内。点击 BACK，回到原来界面。（3） 设置阈值-gating收集阳性孔斑点—collect POS Wells，点击阳性孔，孔上会出现 P 的标记，然后点击 finish。收集阴性孔斑点—collect Neg Wells，点击阴性孔，孔上会出现 N 的标记，然后点击 finish。点击 auto-adjust，机器会自动设置阈值。如果阴性孔没有斑点，直接在阳性孔上调节阈值。白色圆圈代表非特异性斑点，其大小在最小阈值以下。点击 start autocount，开始计数。质控1. 点击质控—quality control。2. 点击 add plates，选择添加板子后，观察板子状态，如果为计数，则状态为 scan，如果已经计过数，则状态为 counted。3. 点击 start，开始质控。4. 处理有问题的孔，最好每个孔都看一遍。5. 双击要处理的孔。（1） 降低灵敏度，然后点击 count，可以去除一些杂质。注意：调节灵敏度会使一些颜色较浅的信号斑点消失。（2）删除斑点：高级设置 advanced setting—去除斑点 audit spots，然后点击 count，双击选中的杂质斑点，右击选择 YES 即可删除杂质斑点。删除的斑点系统自动用黑色圆圈圈上。（3）删除区域：高级设置 advanced setting—手动模式 manual mode，然后点击 count，这时可以画圈选取不想要的区域，然后右击闭合，即可选中。点击 manual mode 旁边的 setting，可以在 manual 中选中 normalize，ignore 等选项，normalize 即选圈中的部分仍然技术，ignore 则为忽略不计数。（4）zero：适用于全部阴性孔，可全部删除杂质。（5）TNTC：too numerous to count，即斑点太多而无法计数，需要下次实验调整细胞数目。6. 点击 finish to next plate 即完成一块板子。